INTRODUCCIÓN

Aunque los mecanismos de señalización que subyacen a las diversas respuestas a la insulina son altamente complejos y aún hay aspectos por esclarecer, los avances recientes han aportado cierta claridad en algunas vías esenciales que rigen la regulación metabólica de la glucosa. Los efectos de la insulina abarcan una amplia gama de procesos, como el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis y la síntesis, así como la degradación de lípidos, proteínas y glucosa. En cuanto al almacenamiento de nutrientes, se ha establecido que la unión de la insulina a su receptor inicia una compleja cascada de señalización que promueve la captación y almacenamiento de glucosa y ácidos grasos en forma de glucógeno y triglicéridos¹.

Uno de los efectos funcionales más estudiados de la señalización de la insulina en el músculo esquelético (ME) es el aumento en el transporte de glucosa². La interacción entre la insulina y el ejercicio sirve como ejemplo de un equilibrio entre dos fuerzas reguladoras metabólicas contrapuestas en condiciones variables³. Durante la actividad física es necesario incrementar la movilización y la oxidación de las reservas energéticas, contrarrestando así los efectos del almacenamiento promovidos por la insulina. Para lograrlo, durante el ejercicio se reduce la secreción de insulina y se favorecen los procesos de movilización de energía. Tras la actividad física, es imperativo restablecer los depósitos energéticos agotados, en particular el glucógeno muscular. La sensibilidad a la insulina de los músculos que participaron previamente en la actividad física aumenta, lo que facilita la captación de glucosa para la resíntesis de glucógeno. En personas entrenadas, la sensibilidad a la insulina se eleva aún más en comparación con las no entrenadas debido a las adaptaciones en la vasculatura, el ME y el tejido adiposo.

La insulina ejerce sus efectos fisiológicos mediante su unión al receptor de insulina (RI) ubicado en la membrana plasmática de las células diana. El RI es un heterotetrámero formado por dos subunidades alfa y dos subunidades beta. La porción extracelular de RI la componen las dos subunidades alfa y los 190 residuos aminoacídicos del extremo aminoterminal de cada una de las subunidades beta. La porción restante de las subunidades beta constituye las regiones transmembrana, yuxtamembrana y los dominios con actividad de tirosina-quinasa. La subunidades alfa y beta están unidas por un puente disulfuro, mientras que las subunidades beta se vinculan entre sí por dos puentes disulfuro. El gen que codifica el RI (INSR) es un gen simple ubicado en el cromosoma 19 (19.13.2) que, gracias al splicing alternativo (proceso que permite obtener diferentes proteínas a partir de un mismo gen), sintetiza las isoformas A y B de RI^4,5. La isoforma B es unas 100 veces más sensible a la insulina que a IGF-2 (insulinlike growth factor type-2), y se expresa de manera más frecuente y específica en el hígado, el músculo y el tejido adiposo, mientras que la isoforma A se expresa mayoritariamente durante el desarrollo fetal y tiene una alta afinidad por IGF-2⁶.

El estímulo de RI induce la activación de dos grandes cascadas de señalización intracelular: una cascada con actividad mitogénica y otra con actividad metabólica. En condiciones de insulinorresistencia, la respuesta de la vía metabólica disminuye, mientras que la vía mitogénica permanece inalterada.

La activación metabólica de RI favorece la activación de la tirosina-quinasa en las subunidades beta, autofosforilándose para facilitar el reclutamiento y la activación por fosforilación de diversas proteínas sustrato. Estos eventos posibilitan la división temprana de la señalización desencadenada por la insulina para activar múltiples módulos funcionales⁷.

Entre las proteínas sustrato mejor descritas para RI se encuentra la familia de sustratos del receptor de insulina (SRI, o del inglés IRS: insulin receptor substrate)^8,9. Los SRI son proteínas adaptadoras fosforiladas en residuos de tirosina por el RI activado. La fosforilación de residuos de tirosina por parte del RI permite la unión de proteínas efectoras de señalización, lo que amplifica la respuesta a la insulina, mientras que las fosforilaciones en residuos de serina o treonina afectan su estabilidad y actividad, y gestionan la inhibición o activación en función de los residuos afectados. Los SRI son una familia de proteínas de las que se describieron seis (SRI 1-6). No obstante, SRI-1 y SRI-2 median la mayoría de los efectos metabólicos de la activación de RI⁷.

La fosforilación en tirosina del dominio carboxiloterminal de SRI permite la unión y activación de la enzima fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), la cual cataliza la incorporación de un fosfato sobre la posición 3 del anillo inositol del fosfoinositol-4-fosfato (PI4P) y fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI4, 5P), que genera fosfoinositol-3,4-bifosfato (PI (3,4) P2) o “PIP2”, y fosfoinositol-3,4,5-trifosfato (PI(3,4,5) P3) o “PIP3”, respectivamente¹⁰. La PI3K está formada por una subunidad reguladora y otra catalítica. Existen cinco isoformas de la subunidad reguladora (p85a, p55a, p50a, p85ß y p55?) y tres isoformas de la subunidad catalítica (p110 a, ß y ?). La unión entre ambas subunidades facilita la estabilización de la subunidad catalítica e inhibe su acción. Cuando la subunidad reguladora se pone en contacto con SRI, se libera la inhibición, lo que activa la subunidad catalítica e incrementa la producción de PIP3^11,12. Esto propaga y amplifica la señal de la insulina y el reclutamiento de proteínas efectoras con dominios PH (o dominios con homología de pleckstrina) sobre la membrana plasmática. Entre los efectores con dominio PH más importantes se encuentran la proteína-quinasa 1 dependiente del inositol-3-fosfato (PDK1), Akt (también denominada proteína-quinasa B: PKB)¹¹ y PKC atípicas (aPKC-? y ?)¹³. Hasta ahora, se han identificado tres isoformas de Akt codificadas por los genes Akt1, Akt2 y Akt3, de las cuales Akt2 se expresa predominantemente en los tejidos sensibles a la insulina¹⁴. Tras unirse a PIP3, Akt se activa mediante la fosforilación por la PDK1 (en treonina 308) y por la mTOR2 (mammalian target of rapamycin complex) (en serina 473)¹⁵ (Figura 1).

Figura 1 .

La Akt activa tiene la particularidad de fosforilar múltiples sustratos con diversas funciones (Foxo, AS160/TBC1D4, TSC-2/TSC-1, PRAS40, GSK3, PGC-1a, PDE3B) y se convierte en un nodo clave para la diversificación de la señalización de la insulina⁷. Al mismo tiempo, PDK1 fosforila y activa las PKC atípicas, las cuales estarían vinculadas a la exocitosis de GLUT-4¹³, probablemente mediante la fosforilación de proteínas sustrato (p. ej., Doc2B, una proteína necesaria para la fusión de las vesículas GSV con la membrana plasmática; Figura 2)^16,17.

Figura 2 .

Como se puede observar, los eventos detallados hasta aquí están próximos a RI (SRI, PI3K y Akt) en las inmediaciones de la membrana plasmática. El cese del estímulo con la insulina permite un mecanismo inverso al descrito. A diferencia de PI3K, la falta de insulina provoca la activación de la fosfatasa PTEN (cuya actividad es inhibida por la acción de la insulina) que desfosforila PIP3 y frena la activación desencadenada por la insulina¹⁸.

Tráfico de vesículas. Papel de las proteínas Rab

Como ya se mencionó, Akt fosforila diversas proteínas involucradas en la captación de glucosa y es el sustrato de Akt de 160 kDa (AS160) el mejor caracterizado de sus blancos. La AS160, también conocida como TBC1D4, es una proteína GAP y tiene actividad sobre las proteínas Rab 8, 13 y 10. En ausencia de insulina, AS160/TBC1D4 permanece activa y estimula la actividad GTPasa de Rab, con la consiguiente hidrólisis de GTP a GDP y Pi de manera constitutiva (Figura 4). En otras palabras, las Rab estarían inactivas, cargadas con GDP, en estado basal o constitutivo. La activación de Akt2 por la insulina permite la fosforilación de AS160 e inhibe su actividad GAP, lo que impide la activación de GTPasa de Rab. Esto facilita que permanezcan cargadas con GTP, es decir, como Rab-GTP, y que se active el tráfico de vesículas hacia la membrana plasmática (Figura 5). En resumen, a través de la fosforilación de AS160, la insulina “soltaría los frenos” de las proteínas Rab y haría posible la translocación de GSV a la membrana plasmática²².

Figura 4 .

Figura 5 .

La activación de PI3K es un punto clave porque facilita la bifurcación de la señalización de la insulina. Paralelamente a la activación de Akt, PI3K promueve la activación de una GTPasa perteneciente a la familia de las proteínas Rho (Ras homologous) denominada RAC-1²². Hoy sabemos que la activación de RAC-1 coordina la reorganización de la actina cortical por debajo de la membrana plasmática, evento necesario para el acoplamiento y la fusión de GSV con la membrana plasmática^23,24. Una pregunta parcialmente respondida es: ¿cómo el incremento de PIP3 (generado por la activación de PI3K) permite la activación de RAC-1? Como todas las proteínas con actividad GTPasa, RAC-1 también requiere proteínas GAP y GEF. Algunos estudios demostraron que el aumento de PIP3 en la membrana plasmática permite el reclutamiento de proteínas GEF para RAC-1, como P-Rex 1²⁵ y FLJ00068²⁶. Gracias a estas proteínas GEF, RAC-1 se activaría, es decir, se cargaría con el nucleótido GTP. Como ya se mencionó, la activación de RAC-1 conduce al reordenamiento de la actina en la zona cortical. Para que este evento sea factible, es necesario un aumento tanto de la ramificación (polimerización) como de la despolimerización de la actina fibrilar. Así, RAC-1 activa factores nucleadores como WAVE y n-WASP (neuronal WiskottAldrich syndrome protein), que a su vez activan un complejo de factores de ramificación de la actina denominado Arp2/3. Otra proteína blanco de RAC-1 es la quinasa PAK1, que por intermedio de una fosfatasa (Slingshot) desfosforila y activa otra proteína (cofilina), responsable de la despolimerización de la actina fibrilar, con regeneración de la actina monomérica libre³.

Un estudio realizado por Sylow, de la Universidad de Copenhague, demostró que, tanto en ratas alimentadas con dieta rica en grasa como en personas obesas, ambas insulinorresistentes, se observa una disminución de la fosforilación de PAK1 muscular²³. Por otro lado, en personas sometidas a condiciones de insulinorresistencia por emulsión lipídica intravenosa, la fosforilación de PAK-1 se bloquea de manera total (100%) a los 30 minutos y parcial (50%) a los 120 minutos tras la estimulación con insulina²³. Así, la falta de fosforilación de PAK-1 disminuye o bloquea la activación de cofilina, lo que reduce la hidrólisis de la actina fibrilar, y la presencia de actina monomérica, provocando una disfunción de la dinámica de actina y, con ello, del transporte de GLUT-4 a la membrana plasmática²⁷ (Figura 6).

En resumen, la activación de RAC-1 genera el reordenamiento de la actina cortical, necesaria para la ramificación de los haces de actina y para la despolimerización de la actina fibrilar. Debido a este aumento de la actina cortical por debajo de la superficie celular, las GSV cargadas con GLUT-4 se aproximan a la membrana plasmática y se fusionan con ella²⁸.

Figura 6 .

Los eventos finales en la exocitosis de GLUT-4 suceden en los últimos 200 nm por debajo de la membrana plasmática, donde existen factores reguladores del anclaje (tethering), el acoplamiento (docking) y la fusión (fusion) de GSV con la membrana plasmática (Figura 7). Si bien estos eventos han sido ampliamente estudiados por diferentes grupos^29-31, al igual que ocurre en varios de los procesos descritos, aún quedan preguntas sin respuesta. Algunos estudios proponen que ciertos estados de insulinorresistencia pueden estar causados por cambios en las proteínas implicadas, o al menos relacionadas, con esta fusión de membranas (para conocer más sobre qué proteínas están involucradas, sugerimos leer el artículo de Bryant et al. “SNARE proteins underpin insulinregulated GLUT-4 traffic”). En cuanto al evento de fusión, en líneas generales se sabe que la fusión de membranas intracelulares requiere un complejo de proteínas de membrana denominadas SNARE (soluble NSF, N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment protein-receptors, receptores de proteínas de fijación soluble de NSF). Las SNARE tienen la particularidad de presentar estructuras espiraladas, lo que permite el entrelazado entre ellas (SNARE de membrana plasmática y SNARE de vesículas) y genera el acercamiento estrecho entre la membrana vesicular y la membrana plasmática. Todo ello posibilita superar la energía de repulsión electrostática entre ambas membranas y, por consiguiente, la fusión.

Figura 7 .

Tres proteínas principales componen el complejo SNARE involucrado en la fusión de las vesículas GSV: 1) proteína de membrana asociada a vesículas-2 (VAMP-2) ubicada sobre las GSV (v-SNARE o SNARE de vesículas); 2) sintaxina 4; 3) SNAP 23 ambas ubicadas sobre la membrana plasmática (t-SNARE o SNARE del compartimento target)^31,32. También se observó la participación de una serie de proteínas capaces de regular, de manera muy precisa, la formación y estabilidad del complejo SNARE³. Una de las más estudiadas es Munc18c, que se une a un precomplejo formado por sintaxina 4-SNAP 23, e impide la unión de VAMP-2 y la formación del complejo SNARE y, por consiguiente, la fusión de las membranas. Por otro lado, la activación del RI promueve la fosforilación de Munc18c, posibilita que esta se desprenda de la unión con sintaxina-4-SNAP 23 y, así, la formación del complejo SNARE y la fusión de las membranas^33-35. En cambio, en estado basal (ausencia de insulina) la fosfatasa PTP1B mantiene desfosforilada a Munc18c, lo que facilita su unión a sintaxina 4-SNAP 23 e inhibe la formación del complejo ternario SNARE y la fusión³⁶. Otra proteína denominada Synip funciona de forma similar a Munc18c. No obstante, Synip se une a sintaxina 4 en estado basal, lo cual bloquea la formación del complejo SNARE. Sin embargo, la activación de Akt2 por la insulina posibilita la fosforilación de Synip y la libera de la unión con sintaxina 4, lo que promueve el ensamblaje del complejo SNARE^37-39. Por el contrario, la proteína de unión al calcio Doc2b, que es citosólica en estado basal, migra a la membrana plasmática por acción de la insulina y favorece la formación del complejo SNARE y, por lo tanto, la captación de glucosa^40-42 (Figura 8)³.

Figura 8 .

Recientemente, nuestro grupo del Instituto de Histología y Embriología de Mendoza (Pavarotti et al.), en colaboración con el grupo de la Dra. Klip, del Hospital for Sick Children (SickKids) de Toronto, Canadá, encontró por primera vez en el músculo y en las células musculares la proteína complexina 2, una proteína vinculada a la estabilización de SNARE en los eventos de neurotransmisión en el sistema nervioso^43,44. Los estudios microscópi cos mostraron que la complexina 2 migra hacia la membrana plasmática por acción de la insulina, un evento dependiente de RAC1 e independiente de Akt2. Por otra parte, los ensayos de knock-down (o disminución de la expresión de complexina 2) muestran una reducción de la exocitosis de GLUT-4 dependiente de la insulina⁴⁵. Sin embargo, como se mencionó y se analizó en nuestro artículo y posteriormente en otro artículo del grupo del Dr. Bertrand de Bélgica, que comenta y discute nuestros resultados⁴⁶, aún desconocemos si la complexina 2 está involucrada en la exocitosis de GLUT-4 mediada por otros estímulos como el ejercicio físico, la activación de AMPK o los aumentos de Ca²⁺ (Figura 9).

Figura 9 .

Como puede observarse, los complejos SNARE y sus proteínas reguladoras influyen directamente en la modulación de la homeostasis glucémica, por lo que una caracterización minuciosa de los mecanismos que regulan la formación y estabilidad del complejo SNARE será de gran importancia para diseñar nuevas intervenciones en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) con el fin de restaurar la captación de glucosa estimulada por la insulina.

La ausencia de complexina 2 disminuye la exocitosis de GLUT-4 desencadenada por la insulina. Bajo la acción de la insulina, complexina 2 migra a la membrana plasmática y es dependiente de RAC1, pero no de Akt2, para su relocalización. Desconocemos si otras proteínas como AMPK o CaMKII son capaces de permitir su llegada a la membrana plasmática.

La glucosa, que entra en el miocito tras la estimulación con la insulina, tiene principalmente dos destinos posibles: la glucólisis o la síntesis de glucógeno. Tanto en el ME de sujetos sanos como en individuos con DM2, la principal vía de utilización de la glucosa es la síntesis de glucógeno. Se sabe que el glucógeno está sujeto a una regulación aguda por parte de la insulina tanto de los efectos anabólicos (glucógeno-sintasa [GS]) como catabólicos (glucógeno-fosforilasa [GP])⁴⁶. La síntesis de glucógeno en el ME, estimulada por la insulina, es principalmente una consecuencia del aumento en el transporte de glucosa y la subsiguiente regulación alostérica de GS. Además, la insulina modula la actividad y aumenta la transcripción de la hexoquinasa II, la principal isoforma muscular de la primera enzima en la vía glucolítica, lo que proporciona un vasto control de la capacidad glucolítica. La regulación aguda en la síntesis del glucógeno se produce por la acción alostérica de la glucosa-6-fosfato sobre la GS y por la acción de la insulina, que promueve su desfosforilación. La GS fue la primera enzima cuya regulación por la insulina se demostró en 1960⁴⁷. La regulación de GS basada en su desfosforilación desencadenada por la insulina ocurre a través de la activación de Akt, la cual fosforila e inactiva la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3) (Figura 10). En ausencia de insulina, GSK3 desempeña un papel inhibidor en la síntesis de glucógeno, ya que fosforila e inactiva la GS e impide la síntesis de glucógeno muscular. Por el contrario, la activación de Akt, por acción de la insulina, permite la fosforilación de GSK3 inactivándola, lo que impide la fosforilación de GS. La falta de fosforilación de GS aumenta su actividad y, por lo tanto, la síntesis de glucógeno. Simultáneamente a la fosforilación de GSK3, la insulina activa una proteína fosfatasa 1 (PP1) que promueve la desfosforilación de GS (Figura 11). Así, la combinación de la inactivación de GSK3 y la activación de PP1 refuerza la activación de GS, y facilita la síntesis de glucógeno. El estado de fosforilación de GS provo caría una regulación fina al modular la afinidad de la enzima por el sustrato UDP-glucosa* y la sensibilidad a la glucosa-6-fosfato. En otras palabras, la GS desfosforilada sería más sensible a la regulación alostérica por la glucosa-6-fosfato, lo cual parece favorecer la activación de la síntesis de glucógeno estimulada por la insulina⁴⁷. En el lado catabólico del metabolismo del glucógeno, se sabe que la insulina inhibe la glucogenólisis. La actividad de GP es regulada por la insulina mediante mecanismos muy similares a los de GS: fosforilación y regulación alostérica. Por efecto adrenérgico y de la contracción muscular, se activa la fosforilasaquinasa que, a su vez, estimula la GP e induce la liberación de residuos de glucosa-1-fosfato⁴⁸. Contrariamente, la insulina, a través de la activación de la fosfatasa PP1, promueve la desfosforilación y la inactivación de la fosforilasa-quinasa y de GP, lo cual reduce la glucogenólisis muscular. Al igual que con GS, el control alostérico de GP a través de la inhibición de la glucosa-6-fosfato es un mecanismo crítico para el control de la glucogenólisis por parte de la insulina. Así, ambos mecanismos puestos en marcha por la insulina permiten, por un lado, disminuir la glucogenólisis y, por el otro, favorecer la síntesis neta de glucógeno.

Figura 10 .

Figura 11 .

La insulina es la principal hormona anabólica que aumenta el depósito de reservas energéticas en forma de glucógeno y lípidos. Por el contrario, la actividad física es una condición catabólica que aumenta la movilización de carbohidratos y lípidos para la generación inmediata de energía. La disponibilidad de ATP es fundamental para la actividad contráctil del ME tanto en eventos de potencia explosiva, que duran segundos, como de resistencia aeróbica, que duran horas. Por lo tanto, el ATP es el combustible celular requerido para la actividad de las enzimas claves involucradas en la excitabilidad de la membrana (Na⁺/K⁺ ATPasa), el manejo del Ca²⁺ del retículo sarcoplásmico (Ca²⁺ ATPasa), los ciclos de entrecruzamiento de actina y miosina, etc. Sabemos que las reservas intramusculares de ATP son escasas: ~5 mmol por kilogramo de músculo. Si el ATP almacenado fuera la única fuente de energía del músculo, entonces la duración de la actividad contráctil para el ejercicio máximo (p. ej., carreras de 100 m), donde la tasa estimada de utilización de ATP es de 3,7 mmol ATP kg-1 s-1, sería de solo 2 segundos, mientras que para el ejercicio submáximo, al 75% de VO₂ máx, donde la tasa de utilización de ATP es de 0,4 mmol kg-1 s-1, las reservas alcanzarían para unos 15 segundos.

Como ya señalamos, la captación de glucosa muscular puede aumentar unas 100 veces durante el ejercicio intenso. Los mecanismos coordinados responsables de este fenómeno son: 1) el aumento del suministro de glucosa; 2) el incremento del transporte de glucosa; 3) la activación de las vías glucolítica y oxidativa⁵³.

Si bien el aumento de la translocación de GLUT-4 desencadenado por el ejercicio es un hecho bien estudiado, todavía hay aspectos no bien dilucida dos o, al menos, discutibles. Desde siempre, se ha supuesto que la activación de AMPK por cambios en la relación de AMP/ATP permite un aumento de la translocación de GLUT-4 y, con ello, una mayor captación de glucosa^60,61. Sin embargo, se han propuesto otros posibles mecanismos^62-65. El aumento de GLUT-4 en la membrana plasmática por la insulina y la actividad física se produce a través de vías de señalización independientes, pero teniendo en cuenta que el ejercicio induce un aumento de la sensibilidad a la insulina durante y después de la actividad, podría considerarse que esta independencia es una verdad a medias. Es decir, se han encontrado puntos en los que ambas vías convergen y comparten parte de los mecanismos utilizados para aumentar la exocitosis de GLUT-4.

La activación de AMPK (a2ß2?3/1) por estrés metabólico (incremento de la relación AMP/ATP) o por fármacos similares al AMP (p. ej., AICAR), se ha relacionado con la translocación de GLUT-4 a la membrana plasmática⁶⁶. En apoyo de estas observaciones, se notó un aumento aproximado del 90% en las reservas de glucógeno en las personas que poseen una mutación puntual en la subunidad ?3 de AMPK, que conduce a un aumento de la actividad intrínseca⁶⁷. Surge la pregunta: ¿cómo aumenta la activación de AMPK la translocación de GLUT-4? AMPK está vinculada a la activación de proteínas Rab y al aumento de fosfatidilinositol 3,5-bifosfato (PI(3,5)P2). Como ya mencionamos, las proteínas GAP (GTPases activating protein) están activas en estado de reposo, lo que facilita la hidrólisis de Rab-GTP a Rab-GDP y Pi mediante la inhibición de Rab y el tráfico de vesículas. De manera similar a la activación de Akt2 por la insulina, la activación de AMPK por la actividad física permite la fosforilación de la proteína GAP, TBC1D4/AS160 y, probablemente, de otra GAP denominada TBC1D1, que se encuentra presente principalmente en las fibras de tipo 2. Así, la fosforilación y la inhibición de ambas GAP contribuirían a la carga de Rab con GTP y liberarían el freno al tráfico de las vesículas GSV, con la consiguiente exocitosis de GLUT-4. Por el momento, se desconoce qué proteínas Rab participan en este proceso, pero dadas las similitudes observadas con los mecanismos estimulados por la insulina, Rab 8, 13 y 14 serían las principales candidatas. También se ha descubierto que AMPK tiene como blanco la quinasa PIKfyve, que habilita la generación de fosfatidilinositol-5-fosfato (PI(5)P) y fosfatidilinositol-3,5-bifosfato (PI(3,5)P2)⁶⁸. En cuanto al incremento de PI(3,5)P2, la actividad de PIKfyve se ha vinculado a un aumento de la exocitosis de GLUT4, pero AMPK solo parece provocar un cambio en la localización intracelular de esta quinasa⁶⁸, lo que contribuiría al aumento de la exocitosis de GLUT-4.

Por último, según algunos estudios, la sacarosa-quinasa no fermentada relacionada con AMPK (SNARK) parece estar vinculada a la regulación del metabolismo de la glucosa y la captación de glucosa en el ME en respuesta a la contracción muscular⁶⁹. Más concretamente, se cree que SNARK se activa por la contracción muscular y esta última activa la AMPK, lo que permite la translocación de GLUT-4, donde participa como un “amplificador” para aumentar la respuesta metabólica a la contracción muscular (Figura 12, panel central).

Figura 12 .

Los incrementos de Ca²⁺ desencadenados por la contracción muscular tienen múltiples orígenes y secuencialidades, y se los ha vinculado a eventos de señalización como la activación de quinasas (p. ej., CaMKK, CaMKII, nPKC), el aumento de la exocitosis de GLUT-4 y la incorporación de glucosa^70,71. El cambio de potencial de la membrana generado por el estímulo nervioso sobre la placa motora terminal posibilita la apertura de canales de Ca²⁺ denominados receptores de dihidropiridina (R-DHP), los cuales, por contacto físico con los canales denominados receptores de rianodina (RyR, ryanodin receptor), ubicados en las cisternas terminales del retículo sarcoplásmico, permiten un incremento mayor de Ca²⁺ intracelular por la salida desde este compartimento. El aumento de Ca²⁺ es el responsable final de la contracción muscular, es decir, de generar el entrecruzamiento entre la actina y la miosina. Se notó que, si se bloquea farmacológicamente este entrecruzamiento, se inhibe la exocitosis de GLUT-4⁶⁰. Sin embargo, este aumento de Ca²⁺, mediado por los receptores de R-DHP y RYR en las cisternas terminales del retículo sarcoplásmico, no serían los responsables de generar un mayor ingreso de glucosa⁶⁰. Por otra parte, el aumento de la glucólisis por estímulos eléctricos produce un aumento de segundos mensajeros como ADP ribosa cíclico (cADPR) y ácido nicotínico adenina dinucleótido fosfato (NAADP)⁷², los cuales generan un incremento extra de Ca²⁺ (proveniente del interior y el exterior celular) y la activación de CaMKII^73,74. Además, estos incrementos de Ca²⁺ son detectados por la calmodulina (CaM), evento que también sería necesario para activar la CaMKII⁷⁵. En este sentido, el bloqueo de la activación de CaMKII frena la incorporación de glucosa. En función de lo expuesto, y según nuestro punto de vista, las señales de Ca²⁺ desencadenadas por el propio proceso contráctil (aumento del calcio intracelular por R-DHP y RyR) no serían responsables de la incorporación de glucosa muscular por el ejercicio físico. No obstante, las moléculas provenientes de la actividad glucolítica actuarían como segundos mensajeros, y permitirían los incrementos subsiguientes de Ca²⁺ tanto desde el interior como desde el exterior de la célula, lo que dispararía a través de calmodulina y CaMKII la incorporación de glucosa.

Las señales de Ca²⁺ generan mecanismos y eventos complejos aún no dilucidados del todo, pero que parecen tener un impacto positivo en la incorporación de la glucosa muscular.

Alternativamente a esta vía y en relación con la apertura de los canales de Ca²⁺ durante la contracción muscular (receptores de rianodina, ubicados sobre las cisternas terminales), parece producirse la liberación de ATP al exterior celular a través de los canales de panexina-1^62,76. En estos estudios se halló que tales eventos provocan un aumento de la fosforilación de Akt y de TBC1D4/AS160 durante el ejercicio físico⁷⁷. Al parecer, el incremento del ATP extracelular provoca una activación autocrina de los receptores purinérgicos P2Y del miocito, los cuales activan una PI3K? e incrementan los niveles de PIP3. Esto permitiría el accionar de la señalización posterior de PIP3 utilizando la vía común de la insulina e incrementando la captación de glucosa^62,78 (Figura 12, panel izquierdo).

Si se bloquea la tensión muscular generada por la contracción, ya sea mecánica o químicamente, se observa una reducción en la captación de glucosa^60,79. Esto parece indicar que la señalización desencadenada por el estrés mecánico durante la actividad física está relacionada con los eventos de incorporación de glucosa. De manera similar, se ha demostrado que el estiramiento pasivo aumenta la incorporación de glucosa al músculo⁷⁹. Una candidata que podría explicar el efecto del estiramiento en la incorporación de glucosa es la proteína RAC-1. Si bien RAC-1 es activada por la insulina, el estiramiento pasivo también activaría a RAC-1 y permitiría la incorporación de glucosa^24,80. En roedores y seres humanos, la quinasa PAK, blanco de RAC-1 activado por la insulina, también se activa por el ejercicio físico y en el proceso contráctil⁸¹. La inhibición farmacológica de RAC-1 o la supresión de su expresión produce una disminución del 30-40% en la incorporación de glucosa estimulada por el estiramiento pasivo⁷⁹. Se han estudiado proteínas de la membrana plasmática que serían las encargadas de captar los cambios de tensión sobre el miocito mediante la activación de RAC-1. Entre las proteínas estudiadas están el complejo glucoproteico de la distrofina (DGC: dystrophin glycoprotein complex), canales iónicos, uniones de adhesión focal e integrinas, que tienen la capacidad de detectar cambios de tensión, y que serían necesarias para activar a RAC-1^82-84. Una vez activada RAC-1, se especula que podría ejercer su acción en al menos tres sitios distintos para promover la incorporación de glucosa: 1) al igual que en la señalización promovida por la insulina, aquí también RAC-1 estimularía el reordenamiento del citoesqueleto de actina²⁴; 2) RAC-1 también activaría otra GTPasa denominada RALA (proteína Ral-A asociada a Ras), que parece estar implicada en el tráfico de GLUT-4⁸⁵; 3) RAC-1 formaría parte del complejo NOX2 (NADPH oxidasa 2), el cual se ha vinculado a la incorporación de

glucosa muscular mediante el proceso contráctil⁸⁶.

En conclusión, tanto el bloqueo de la actividad de RAC-1 como su ausencia provocan una disminución parcial en el ingreso de glucosa. Esto nos autoriza a pensar que existen otros mecanismos y moléculas capaces de modular este proceso activado por l contracción muscular y el estiramiento pasivo (Figura 12, panel derecho). En la Figura 12 se resumen esquemáticamente los tres mecanismos propuestos.

En la actividad física se observa una marcada disminución de los niveles de insulina debido a la inhibición alfa-adrenérgica de las células beta pancreáticas⁸⁶. No obstante, se ha sugerido que se requiere un mínimo nivel “permisivo” de insulina para lograr una incorporación más eficaz de glucosa⁸⁷. Si bien la insulina parece innecesaria para la captación de glucosa inducida por la contracción⁸⁸, se cree que existe una sinergia entre los efectos de la actividad física y la insulina, lo que podría estar vinculado a un mayor flujo sanguíneo muscular, como a un incremento en la translocación de GLUT-4. Una observación en consonancia con la sinergia propuesta es que la insulinopenia extrema durante el ejercicio reduce la captación de glucosa por el músculo⁸⁹. Sin embargo, es más probable que esto se deba a la severa hiperlipidemia asociada a la deficiencia de insulina que a los efectos directos de la falta de insulina¹. Defronzo et al. realizaron en 10 sujetos sanos un clamp euglucémico e hiperinsulinémico con cateterismo arterial y venoso de un miembro inferior, el cual fue seguidamente sometido a 30 minutos de ejercicio⁹⁰. La absorción de glucosa aumentó notablemente como resultado de un incremento de nueve veces en el flujo sanguíneo y una diferencia de cuatro veces en la relación arteriovenosa de la glucemia. Este incremento en la captación de glucosa fue significativamente mayor que la suma de la actividad física sola y la insulina sola, lo que demuestra que la acción conjunta o simultánea, entre la hiperinsulinemia y el ejercicio, provoca una acción sinérgica. En este sentido, la ingesta de hidratos de carbono durante la actividad física es beneficiosa, ya que produce un aumento de los niveles de insulina, lo que incrementa aún más la captación de glucosa muscular, con una probable contribución adicional del aumento de la glucemia per se tras la ingesta⁸⁸. Hoy se sabe que el entrenamiento físico regular provoca un aumento de la densidad capilar muscular en los seres humanos. Por otra parte, la insulina también induce un aumento de la densidad capilar y de la vasodilatación que conduce a un mayor suministro de nutrientes. Por lo tanto, podemos concluir que la actividad física y la insulina son mecanismos sinérgicos que contribuyen a la mejora sostenida de la captación de glucosa estimulada por la insulina después del entrenamiento regular⁶⁶.

Además del aumento de la captación de glucosa muscular durante la actividad física, se produce un incremento en la captación de glucosa después de la actividad. La captación de glucosa aumenta hasta 4 horas después de la actividad, con independencia de la insulina. Luego, en una segunda fase posactividad, se observa una mayor sensibilidad a la insulina que dura cerca de 48 horas⁹¹. Esto se debe principalmente a un mecanismo local inducido por la contracción del músculo activo. Así, el ejercicio con una sola pierna conduce a una captación de glucosa muscular estimulada por insulina dos a cuatro veces mayor tras el ejercicio en comparación con la pierna no ejercitada⁹². Además, la sensibilidad a la insulina de los músculos no activos disminuye, lo que indica que las respuestas sistémicas al ejercicio exhaustivo prolongado (¿debido a la elevación de catecolaminas y de ácidos grasos?) pueden disminuir la acción de la insulina en los músculos no involucrados en el ejercicio. Fisiológicamente, esto tiene sentido, ya que una resistencia leve a la insulina en los músculos inactivos redistribuiría la glucosa sanguínea a los músculos activos. La sensibilidad a la insulina de todo el cuerpo tras el ejercicio dependerá, entonces, de la relación entre los músculos activos e inactivos, así como de la duración y la intensidad del ejercicio⁹³. Todo ello justificaría ampliamente indicar la realización de ejercicios aeróbicos y de fuerza, con la premisa de utilizar el mayor número posible de músculos y grandes grupos musculares.

La mayor sensibilidad a la insulina tras el ejercicio puede explicarse, en parte, por un aumento en la respuesta vasodilatadora del lecho microvascular a la insulina debido a un incremento del óxido nítrico (NO), probablemente por fosforilación y activación de eNOS por acción de AMPK en las células endoteliales durante el ejercicio⁹⁴.

Además de aumentar la respuesta vasodilatadora a la insulina en el período posterior al ejercicio, existen mecanismos moleculares en el miocito responsables del aumento de la translocación de GLUT-4 por la insulina que no modifican los pasos proximales de la señalización de la insulina. En otras palabras, la posactividad no incrementa la actividad tirosina-quinasa de RI, la fosforilación de tirosina del IRS1, la actividad de PI3K asociada a IRS1 ni la fosforilación de Akt2¹. Llamativamente, tampoco se debería a una mayor síntesis de

GLUT-4⁹⁵. Por otro lado, aunque la actividad de GS aumenta después de la depleción de glucógeno muscular provocada por el ejercicio, esto no se debería a un mayor efecto de la insulina⁹⁶.

Para comprender el aumento de la sensibilidad a la insulina tras la actividad física en el ME se debe prestar atención a los elementos comunes en ambas vías, es decir, los eventos moleculares que se activan tanto por la actividad física como por la insulina y que involucran la translocación de GLUT-4. Deberíamos centrar nuestra atención en los activadores de la exocitosis de GLUT-4 que persisten activos después de la actividad y en la recuperación. De esta manera, la insulina podría causar una activación adicional de los elementos ya activos posactividad y desencadenar una mayor incorporación de glucosa. Entre los elementos comunes activados por la insulina y por la actividad física la proteína GAP, TBC1D4/AS160 surge como molécula candidata, ya que además de ser fosforilada en varios sitios por acción de la insulina, es fosforilada en otros residuos por acción de la actividad física. Se ha demostrado que los ratones con desactivación génica (knockout, KO) para TBC1D4/AS160 incorporan glucosa normalmente durante el ejercicio, pero la sensibilización a la insulina se bloquea durante el período posterior a la actividad⁹⁷, lo que avalaría que TBC1D4/AS160 es el elemento clave de la sensibilización posterior al ejercicio. Por otro lado, su parálogo TBC1D1 también sería responsable de la translocación de GLUT-4 estimulada por la actividad física, pero no estimulada por la insulina⁹⁸. Por lo tanto, se cree que ambas proteínas GAP (TBC1D4/ AS160 y TBC1D1) tienen similares Rab como proteínas blanco (Rab 13, Rab 8), lo que puede explicar la activación del mismo evento (exocitosis de GLUT-4) con estímulos diferentes. Sobre la base de experimentos en ratones KO para AMPK, esta última parece ser en gran medida responsable de la fosforilación de TBC1D4/AS160 durante el ejercicio y, de hecho, el ME de estos animales no evidencia una mayor sensibilidad a la insulina en la posactividad⁹⁹. En otras palabras, la activación de AMPK y TBC1D4/AS160 en la actividad física sería responsable del aumento de la sensibilidad a la insulina tras el ejercicio.

Los efectos de una sola sesión de ejercicio sobre el aumento de la sensibilidad a la insulina duran como máximo 48 horas. No obstante, el entrenamiento regular induce adaptaciones más duraderas, y mejora la acción de la insulina tanto en las personas sanas como en los pacientes con DM2, incluso en mayor magnitud que los fármacos utilizados contra la DM.

Algunos de los efectos observados con el entrenamiento regular incluyen una mayor expresión de proteínas involucradas en la cascada de señalización de la insulina, el aumento en la cantidad de GLUT-4, la mayor cantidad de hexoquinasa II y de glucógeno, y la mayor cantidad y volumen de las mitocondrias¹⁰⁰. No obstante, estos mecanismos propuestos son controvertidos y se necesitan más investigaciones al respecto.

El entrenamiento físico regular también mejora la sensibilidad a la insulina y la vascularización del tejido adiposo². En un estudio en seres humanos después de 10 semanas de entrenamiento se observó un aumento de la sensibilidad a la insulina en el tejido adiposo subcutáneo evaluado por la supresión de la lipólisis, y mayor expresión de proteínas del receptor de insulina y de hexoquinasa II. Por lo tanto, al igual que el ME, el entrenamiento parece potenciar la acción de la insulina en el tejido adiposo³.

En síntesis, la insulina y la actividad física son, en gran parte, responsables del equilibrio entre los depósitos y las demandas energéticas. Si esta homeostasis energética se altera como en el caso del sedentarismo, la obesidad y la DM2, se generan desequilibrios metabólicos que conducen a diversos estados patológicos. El tejido muscular es un órgano que cumple una función esencial en el metabolismo energético y en la regulación de la glucemia. Si bien conocemos numerosos eventos desencadenados por el ejercicio, aún quedan muchos mecanismos moleculares por estudiar que pueden influir y modular la incorporación de la glucosa en el ME. Se ha demostrado que luego del estímulo contráctil más de mil proteínas musculares cambian su estado de fosforilación; sin embargo, se desconocen en gran medida sus implicaciones metabólicas¹⁰¹. Así, poco a poco, los avances científicos nos ayudan a comprender, aunque de manera muy minimalista, los distintos eventos y regulaciones sobre el ingreso de la glucosa tanto por la insulina como por el ejercicio. Por consiguiente, los conocimientos moleculares y fisiológicos aquí detallados aportan argumentos más que suficientes para apoyar la idea de que la actividad física es fundamental en la regulación de la glucemia, y la convierten en una aliada en el mantenimiento de la homeostasis energética no solo en las personas sanas, sino también en aquellas con patologías metabólicas.

BIBLIOGRAFÍA